Oneyda Julissa Ramírez, Carolina Rodríguez Cariño, Morela de Rolo

La enfermedad causada por el virus de la gripe o «influenza», (SIV, por sus siglas en inglés) debe su nombre a una epidemia ocurrida en humanos en el siglo XV atribuida a la «influencia de las estrellas» en Italia. La primera pandemia de influenza que claramente está descrita fue en 1580. En el siglo XIX ocurrieron unas cuatro pandemias de influenza, y tres referidas en el siglo XX. La pandemia de la llamada gripe española en 1918- 1919 causó un número estimado de 40 millones de muertes alrededor del mundo. El virus de la gripe ha ido evolucionando y cambiando a lo largo de la historia con sus hospedadores, aves y mamíferos, entre los que se encuentran la especie humana y el cerdo (Wrigth y Webster, 2001).

Estructura y clasificación del virus

Los virus de la influenza pertenecen a la familia Orthomyxoviridae (Smith y col., 1933) y se clasifican en tres tipos distintos: A, B y C, Webster y Bean, 1978; Webster y col., 1992; Janke, 2001a). El virión posee una membrana que contiene dos glicoproteínas de superficie (Figura1): la Hemaglutinina (HA) y la Neuraminidasa (NA). La proteína matriz (M) es la más abundante y forma una capa proteica bajo la membrana viral. En el interior se encuentran los complejos de ribonucleoproteína (Webster y col., 1992). El genoma viral es segmentado, está formado por ocho (8) segmentos de ácido ribonucleico (ARN) de cadena sencilla con polaridad negativa.

Figura 1. Estructura del virus de Influenza, con el detalle de sus proteínas de superficie y su genoma segmentado.
Fuente: Wrigth y Webster, 2001.

Existen varios serotipos para las proteínas HA y NA (figura 2). Los cerdos pueden estar infectados con los subtipos H1N1, H1N2 y H3N2 (Brown, 2005). Estos distintos subtipos y distintas variantes antigénicas del virus de influenza están constantemente circulando en los cerdos en diferentes partes del mundo. La influenza porcina (IP) causa muerte súbita y brotes de gripe explosiva en los rebaños. Usualmente pocos cerdos mueren, pero la muerte se incrementa si la influenza se presenta como parte del síndrome del complejo respiratorio porcino (CRP) (Janke, 2001a).

Tabla 1. Proteínas codificadas y segmentos genéticos del virus de influenza A.

Fuente: Adaptado de Lamb y Krug, 1996.

La enfermedad presenta importancia en salud pública debido a que se ha informado la presencia de enfermedades respiratorias agudas en humanos, que han estado en contacto con cerdos afectados con influenza. Esta enfermedad se ha identificado en brotes tanto en el hombre como en los animales.

Serotipos y especies afectadas

Los virus de la gripe de los tipos B y C circulan casi exclusivamente en humanos, mientras que los virus de la gripe tipo A infectan una amplia variedad de aves y mamíferos. Dentro del tipo A, los virus se clasifican en distintos subtipos en base a la antigenicidad de las dos glicoproteínas de superficie: HA y NA. En la actualidad se conocen 16 subtipos serológicos distintos de la proteína HA y nueve (9) de la proteína NA (Brown, 2005).

En las aves acuáticas, los hospedadores naturales del virus, circulan cepas de todos los subtipos conocidos, mientras que en mamíferos y aves de corral sólo se encuentran virus de ciertos subtipos.

Los virus de la gripe humana aislada en el último siglo están restringidos a tres (3) subtipos de HA y dos (2) de NA: H1N1, H2N2 (que circularon entre 1957 y 1968) y H3N2. Desde 2001 se han aislado nuevas cepas del subtipo H1N2 (Garten y col., 2009).

En cerdos circulan virus estrechamente emparentados con los humanos de los subtipos H1N1 y H3N2. En el año 1994 se aislaron cepas del subtipo H1N2 en Reino Unido, y posteriormente en otros países europeos, incluido España, así como en América y Asia (Brown, 2005). En caballos circulan virus de los subtipos H7N7 y H3N8 (Wrigth y Webster, 2001). En las aves de corral circulan virus de diversos subtipos, los más problemáticos por su peligrosidad para el hombre son los encuadrados en los subtipos H5, H7 y H9. Los virus de la gripe aviar causantes del reciente brote que causó mortalidad en humanos en diversos países del sureste asiático y Turquía son H5N1 (Ceyhan y col. 2010)(Figura 3).

Figura 2. Reservorios de los virus de Influenza A. Las aves acuáticas salvajes son el reservorio principal de los virus de influenza para aves y mamíferos. Se ha demostrado la trasmisión entre cerdos y humanos. Existe evidencia de la transmisión entre patos salvajes y otras especies, basados en el análisis filogenético de las nucleoproteínas de un gran número de diferentes virus de influenza
Fuente: Wrigth y Webster, 2001

Mecanismos de variabilidad antigénica

Dos mecanismos dan cuenta de la gran variabilidad antigénica del virus. En primer lugar el virus de la gripe, como todos los virus ARN, presenta una alta tasa de mutación durante su replicación, que se traduce en la acumulación gradual de mutaciones en las proteínas HA y NA, que permiten al virus escapar a la presión inmune del hospedador. Este fenómeno se conoce como deriva antigénica (antigenic drift) y es el responsable de las epidemias anuales del virus de la gripe en humanos, que hacen necesaria la reformulación de las vacunas todos los años. Un tipo de cambio más drástico ocurre cuando se produce, o bien la transmisión directa de una cepa no humana del virus de la gripe al hombre, o bien cuando surge una nueva variante viral a partir del intercambio de segmentos de ARN viral (genetic reassortment) entre dos virus distintos que han infectado una misma célula. Si los nuevos virus incorporan genes de HA o NA de subtipos distintos a los circulantes hasta entonces y presentan una elevada virulencia, podrán propagarse sin control en una población inmunológicamente virgen, provocando pandemias de gran impacto, como ha ocurrido varias veces en la historia (Wrigth y Webster, 2001).

Vías de transmisión

El virus de la gripe se encuentra en equilibrio evolutivo con las aves acuáticas (patos, aves litorales, gaviotas, etc.) propagándose en las mismas sin causar signos clínicos aparentes en la mayoría de los casos. La adaptación del virus a aves que realizan migraciones a grandes distancias es una estrategia evolutiva que le permite una amplia diseminación geográfica sin costo para su hospedador. En las aves acuáticas el virus de la gripe se multiplica principalmente en el intestino, dando lugar a la excreción de gran cantidad de virus en las heces. Por lo tanto, entre las aves acuáticas la vía más común de transmisión es mediante agua contaminada por las heces. La transmisión inicial de las cepas de gripe aviar a mamíferos y aves domésticas probablemente ocurre también por este procedimiento. Otra vía de transmisión puede ser la alimentación de cerdos con deshechos no tratados o restos de aves muertas. Una vez producida la transmisión a otras especies, la propagación del virus de la gripe es principalmente por vía respiratoria.

El cerdo juega un papel crucial en la transmisión del virus entre especies. Los cerdos son susceptibles a prácticamente todas las cepas del virus de la gripe aviar en infecciones experimentales, incluidas cepas del virus H5N1, y también son susceptibles a las cepas que circulan entre humanos, incluida la cepa de la llamada gripe española de 1918, puesto que los virus porcinos y humanos son muy similares y pasan de una especie a otra fácilmente. Las células de la tráquea porcina poseen receptores adecuados tanto para los virus de la gripe aviar como las cepas humanas. Esto permite que ambos tipos de virus infecten a las mismas células en la tráquea porcina, pudiendo originarse así nuevos variantes virales con potencial pandémico. De hecho, los estudios filogenéticos y seroarqueológicos sugieren la implicación del cerdo en la aparición de las cepas causantes de las pandemias humanas del siglo XX: el virus H1N1 de 1918, H2N2 de 1957 y H3N2 de 1968 (Garten y col., 2009; Orsen y col., 2002).

Por otro lado, aunque en los brotes de gripe aviar que han provocado mortalidad en humanos: los de Holanda en 2003 (virus H7N7), y del sureste asiático y Turquía (H5N1), el virus se ha transmitido directamente entre las aves y el hombre, en ambos casos se ha detectado serología positiva en cerdos asociada a los brotes, planteando la posibilidad de que dichas cepas puedan adaptarse al cerdo y posteriormente transmitirse a humanos (Ceyhan y col., 2010). Cabe destacar que tanto en el caso de gripe aviar como en el caso de gripe porcina, estas enfermedades no afectan al estado sanitario de los productos cárnicos de estas especies ni sus derivados y su consumo no entraña ningún riesgo para la salud pública.

Virus de Influenza Porcina en Venezuela

En el año 2002 un médico veterinario de campo notó alta incidencia de problemas respiratorios en las granjas porcinas, se sospechó de la presencia de infecciones por el virus de IP, los cuales fueron referidos en informes veterinarios de campo conjuntamente con resultados de estudios anatomopatológicos; Y a pesar que se habían realizado pruebas de diagnóstico desde el año 2002 que indicaban la respuesta serológica al subtipo H1N1 por medio de la técnica de ELISA, no existía literatura que mencionara la presencia del virus de la IP y/o anticuerpos en los cerdos de rebaños.

Se demostró la presencia de anticuerpos contra el virus de IP subtipos H1N1 (Ramírez y col., 2005), mediante la prueba de inhibición de la hemoaglutinación (IHA). En este trabajo se evaluaron 305 muestras de suero de cerdo provenientes de 10 granjas ubicadas en diferentes estados de Venezuela (Anzoátegui, Aragua, Carabobo, Cojedes, Guárico, Miranda y Zulia). Las muestras de sangre fueron tomadas a 185 lechones en fase de crecimiento–finalización y 120 muestras de madres. Los anticuerpos específicos para el subtipo H1N1 (3/10) y H3N2 (4/10) fueron detectados en siete (7) de las 10 granjas evaluadas. El subtipo H1N1 fue detectado en 7,9% (24/305) de los sueros y el subtipo H3N2 fue positivo en 8,2% (25/305) de los sueros. El análisis serológico evidenció anticuerpos contra el virus de IP, subtipos H1N1 y H3N2, pudiéndose inferir que la presencia de los animales positivos es producto de una infección natural ya que, para el momento del ensayo, no existían vacunas autógenas ni comerciales contra la enfermedad en Venezuela. En el trabajo mencionado, se determinó la distribución de ambos subtipos (H1N1 y H3N2) en las granjas evaluadas, aunque no cohabitando enzoóticamente, en la misma granja.

En el 2006 Boulanger y col.(2010) llevaron a cabo un estudio a fin de evaluar la seroepidemiología de los subtipos H1N1 y H3N2 en granjas de cerdos en Venezuela, durante un período de 10 meses. Se consideró que a pesar que Venezuela no tiene estaciones de clima templado por ser un país tropical, si cuenta con un período de lluvias (finales de Mayo a Noviembre) y un período de sequía (Diciembre a Abril). Sin embargo durante el tiempo del estudio se presentó un patrón climático atípico, con ocho (8) meses de lluvias fuertes y solo dos meses de sequía, durante los cuales se observó reducción en la seroprevalencia de ambos subtipos reportados en el país.

El proyecto titulado Identificación y Caracterización de Agentes Patógenos en Aves, Cerdos y productos terminados usando técnicas biotecnológicas (BID-FONACIT–INIA, 2005- 2008) permitió: (1) aislamiento del virus de IP a partir de muestras de campo, obtenidas de necropsias realizadas en animales con signos clínicos asociados al virus; (2) caracterización genómica mediante la reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa reversa (RT-PCR) y (3) tomar muestras para estudiarlo ultraestructuralmente en líquido corioalantoideo y tejidos de huevos embrionados inoculados con el virus.

La presencia de subtipos H1N1 y H3N2, de cerdos ubicados en granjas del país, refuerza la importancia de considerar al virus de IP en la aparición de los casos de CRP en diferentes explotaciones porcinas nacionales.

Métodos Diagnósticos

Pruebas diagnósticas para detectar Virus, Proteínas Virales (Antígeno) o Ácidos Nucleicos Virales

Prueba de anticuerpos Fluorescentes (AF):

Esta prueba usa un antisuero preparado contra un virus entero (anticuerpo policlonal) o un anticuerpo contra una proteína específica (anticuerpo monoclonal), siendo usualmente aplicada a secciones congeladas de pulmón de cerdos remitidos para examen de laboratorio (Brown y col., 1993) las cuales son vistas bajo un microscopio para identificación de células infectadas con el virus. El anticuerpo usado en esta prueba, en la mayoría de los laboratorios de diagnóstico, es de tipo policlonal, el cuál ha sido preparado por inoculación de cerdos con el virus de IP.

Prueba de inmunohistoquímica (IHQ):

Todos los métodos inmunohistoquímicos se basan en la conjugación de distintos marcadores con moléculas de inmunoglobulinas. Luego de la unión antígeno-anticuerpo, el marcador es localizado de diversas maneras, generalmente por una reacción tintorial, de esa manera se logra detectar en que estructuras se localiza el antígeno problema (Gimeno y col., 2001). Dentro de las más difundidas en la actualidad se encuentra el método del complejo avidina-biotina-peroxidasa (ABC), la cual utiliza la enzima peroxidasa de rábano picante como marcador. Se trata de un procedimiento muy sensible que utiliza anticuerpos marcados y se sustenta en la gran afinidad que tiene la avidina (glicoproteína de alto peso molecular) y la biotina (vitamina H del complejo B, de bajo peso molecular) que se unen por un fuerte enlace formando un complejo no inmune. Comprende tres pasos: incubación con el anticuerpo primario, incubación con el anticuerpo biotilinado y en el tercer paso, aplicación del complejo ABC (Gimeno y col., 2001).

Ensayo inmunoenzimático de captura (Elisa de Captura):

El ensayo inmunoenzimático, mejor conocido como ELISA se fundamenta en que una enzima y su sustrato especifico sirven para visualizar la unión de un antígeno con su anticuerpo especifico, los cuales quedan inmovilizados en los pocillos sin perder reactividad, apareciendo un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso del espectrofotómetro o colorímetro a un longitud de onda adecuada. En el caso del ELISA la presencia de color al adicionar el substrato, indica una reacción positiva. Se ha desarrollado un test de ELISA disponible comercialmente para la detección de influenza en secreciones nasales o faríngeas en humanos también usado en algunos laboratorios veterinarios. Este kit de evaluación detectará tanto los subtipos H1N1 como los H3N2 pero, no permite diferenciar entre ambos subtipos. Ha sido exitosamente usado en secreciones nasales de cerdos vivos así como en secreciones de las vías aéreas pequeñas tomadas directamente desde los pulmones de cerdos durante la necropsia. (Yoon y Janke , 1999; Janke, 2001 b).

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR):

Consiste en la amplificación de un segmento del material genético del virus IP, este segmento codifica para la producción de la glicoproteína interna y es detectada de manera visual en una placa de gel de agarosa. Las muestras más adecuadas para realizar la técnica son: hisopados nasales y pulmón; para los raspados orales se envían los hisopos en tubos con agua peptonada, medio Stuart o infusión cerebro-corazón. Las muestras deben ser remitidas al laboratorio inmediatamente después de haber sido colectadas (Yoon y Janke , 1999; Janke, 2001 b). Las sondas de ácidos nucleicos han sido desarrolladas para detectar los virus de Influenza tipo A y las diferencias entre los subtipos H1N1 y H3N2. Estas pruebas han sido usadas principalmente para caracterizar los virus aislados pero ellas también pueden ser usadas directamente en homogenizados o suspensiones de muestras clínicas sin la necesidad de aislamiento. (Yoon y Janke, 1999; Janke, 2001 b).

Aislamiento viral (AV):

Esta prueba se fundamenta en la recuperación del virus de los tejidos o del suero de animales sospechosos empleando un medio de cultivo idóneo para su multiplicación tales como cultivo celular o animales en etapa de embriogénesis. El virus de IP es fácilmente inactivado por temperaturas superiores a la de congelación, así como por la autolisis generada en los órganos y tejidos de los animales afectados y moribundos. Por ello se recomienda tomar las muestras de animales que estén sufriendo el proceso de manera activa o en su caso sacrificarlos para poder tomar las muestras necesarias, de la mejor manera posible (Swenson, 2000; Janke, 2001 b).

La mejor muestra para el aislamiento de virus de un animal vivo son las secreciones obtenidas por hisopado de los pasajes nasales. Es apropiado almacenar en envases sellados en hielo seco o en nitrógeno líquido pero el virus no es estable a –20°C. (Easterday y Van Reeth, 1999). Históricamente el aislamiento del virus ha sido conducido en huevos de pollos embrionados. Debido a lo costoso que resulta el mantenimiento del suministro continuo de huevos y a los procedimientos intensivos de laboratorio; estos procedimientos toman más tiempo que otros ensayos (1-2 semanas) y son más recomendados para caracterizar virus que para diagnóstico (Swenson, 2000; Janke, 2001 b).

Pruebas diagnósticas para detectar anticuerpos circulantes para el virus de IP

Las pruebas serológicas se emplean para medir el nivel sérico de anticuerpos circulantes, en la cual el agente infeccioso (antígeno), es expuesto al suero de un animal que va a ser probado para permitir que cualquier anticuerpo que esté presente en el suero se una al antígeno y se determina si ocurrió la unión del anticuerpo (Gimeno, 2001).

Inhibición de la Hemoaglutinación (IHA):

Esta es la prueba serológica clásica para detectar anticuerpos contra el virus de la IP. Es relativamente simple y puede ser realizada en unas pocas horas. Esta prueba detecta anticuerpos circulantes unidos a la proteína hemaglutinina (HA) sobre la superficie del virus previniendo que las partículas virales se adhieran a la superficie de los eritrocitos (Swenson, 2000). El suero analizado se mezcla con un virus de concentración conocida y se da un tiempo para permitir que los anticuerpos presentes reaccionen con este virus, el agente indicador (eritrocito de pollo) se adiciona para determinar si el virus en la prueba puede o no aglutinar estos eritrocitos (Yoon y Janke, 1999 ). La cantidad de anticuerpos presentes en el suero es determinada por una serie de diluciones del suero contra una única concentración del antígeno viral, siendo el título la dilución en la cual no hay una cantidad suficiente de anticuerpos presentes para prevenir o inhibir la hemoaglutinación (Swenson, 2000). Existe muy poca reacción cruzada entre las proteínas hemaglutininas (HA) de los subtipos H1N1 y H3N2 de las cepas del virus IP y un ensayo individual puede ser corrido para cada subtipo. Esta prueba es considerada relativamente sensible ya que la proteína HA es bastante antigénica y estimula altos niveles de anticuerpos circulantes (Yoon y Janke , 1999; Janke, 2001 b).

Ensayo Inmunoenzimático (ELISA) Para Anticuerpos:

Ha sido desarrollada en unos pocos laboratorios de investi-gación en U.S.A, pero, algunos estudios comparando los resultados de esta prueba con la prueba de IHA indicaron una pobre correlación entre las 2 técnicas (Swenson, 2000), La técnica de ELISA es conocida como una técnica rápida y sensible para detectar la posible presencia de anticuerpos contra el virus de influenza tipo A. Estos son más fáciles para automatizar que los ensayos de IHA, lo cual será beneficioso porque permitirá evaluar un gran número de muestras (Janke, 2001 b).

Estas técnicas facilitan la interpretación, manejo, control y erradicación de la enfermedad para así evitar que siga emergiendo como un problema de gran importancia económica en los rebaños porcinos nacionales.

Conclusiones

El virus de la gripe ha ido evolucionando y cambiando a lo largo de la historia con sus hospedadores, aves y mamíferos.

Los cerdos pueden estar infectados con los subtipos H1N1, H1N2 y H3N2 estos distintos subtipos y variantes antigénicas del virus de influenza están constantemente circulando en los cerdos en diferentes partes del mundo.

La influenza porcina causa muerte súbita y brotes de gripe explosiva en los rebaños, la mortalidad se incrementa si la influenza se presenta como parte del síndrome del complejo respiratorio porcino.

Los cerdos juegan un papel crucial en la transmisión del virus entre especies, son susceptibles a prácticamente todas las cepas del virus de la gripe aviar y también a las que circulan entre humanos, pudiendo originarse así nuevas variantes virales con potencial pandémico.

En Venezuela el análisis serológico evidenció anticuerpos contra el virus de IP, subtipos H1N1 y H3N2, pudiéndose inferir que la presencia de los animales positivos es producto de una infección natural ya que, no existen vacunas autógenas, ni comerciales contra la enfermedad en Venezuela.

Existen diversas técnicas laboratoriales para el diagnóstico del virus de influenza porcina que detectan anticuerpos, proteínas virales, ácidos nucleicos virales y aislamiento viral.

La enfermedad presenta importancia en salud pública debido a que se ha informado la presencia de enfermedades respiratorias agudas en humanos, que han estado en contacto con cerdos afectados con influenza.

Recomendaciones

Con la finalidad de profundizar en el comportamiento del VIP en Venezuela se requiere continuar realizando:

1. Estudios de prevalencia de la infección del virus de IP, subtipos H1N1 y H3N2.
2. Realizar nuevos aislamientos e identificación del virus de campo.
3. Incorporar pruebas diagnósticas de rutina y laboratoriales, para la detección del virus IP subtipo H3N2
4. Formar nuevo recurso humano para la realización de las diferentes técnicas diagnósticas.
5. Establecer en granjas y laboratorios un protocolo de diagnóstico que incluya esta enfermedad.
6. Informar a los productores y autoridades sanitarias sobre la presencia de la misma, considerando la importancia que tiene desde el punto de vista productivo y sanitario para el cerdo y como riesgo en la salud pública.

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Oneyda Julissa Ramírez1, Carolina Rodríguez Cariño2, Morela de Rolo3.

1M.V., M.Sc.,Dip. Cs Forenses. FCV-UCV, Maracay, Edo. Aragua.
2M.V. Esp. Anatomía Patológica, MSc, PhD. FCV-UCV, Maracay, Edo. Aragua.
3M.V., M.Sc., CENIAP-INIA, Maracay, Edo. Aragua.

oneyda.ramirez@ucv.ve